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雷帕霉素對大鼠血管平滑肌细胞迁移及SDF-1α表达的影响pdf

发布日期:2019-08-14 15:59   来源:未知   阅读:
 

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  雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞迁移及 SDF-1α 表达的影响 硕士研究生:雷建军 导 师:王 佐 教授 中文摘要 目的:探讨雷帕霉素抗血管内再狭窄作用及其与基质细胞衍生因子 1α (SDF-1α)表达的相关性。 方法:①动物实验:20 只 12 周龄 SD 大鼠行颈总动脉球囊拉伤,建立血管 内膜增生的动物模型,随机分为对照组(服用等体积的生理盐水)和雷帕霉素处 理组(口服雷帕霉素),4 周后处死动物。HE 染色观测血管病变,免疫组化检测 增生内膜中 SDF-1α 的表达,小室迁移系统观察 SDF-1α 对平滑肌细胞迁移的影 响,酶联免疫吸附试验检测血清 SDF-1α 水平。②细胞实验:原代培养 SD 大鼠 胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC), MTT 法检测不同浓度的雷帕霉素(0、1、 10、100ng/ml)对 VSMC 增殖的影响,transwell 小室法检测不同浓度的雷帕霉素 (0、1、10、100ng/ml)对 VSMC 迁移的影响,RT-PCR 和 Western blot 分别检 测不同浓度的雷帕霉素(0、1、10、100ng/ml)对 VSMC SDF-1α mRNA 和蛋白 表达的影响。 结果:球囊拉伤明显诱导血管内膜增生,增生内膜中有明显的 SDF-1α 的表 达,雷帕霉素能显著下调增生内膜和血清中 SDF-1α 的表达,且 SDF-1α 能浓度 依赖性地诱导平滑肌细胞的迁移;MTT 法测定结果表明 1、10、100ng/ml 的雷 帕霉素都能显著抑制 VSMC 增殖(p<0.05 或 p<0.01); transwell 小室法检测结果 表明 1、10、100ng/ml 的雷帕霉素都能显著抑制 VSMC 迁移(p<0.05 或 p<0.01), 且呈浓度依赖性;RT-PCR 和 Western blot 检测结果表明,1、10、100ng/ml 的雷 帕霉素都能显著抑制 VSMC SDF-1αmRNA 和蛋白表达(p<0.05 或 p<0.01),且 浓度依赖性明显。 - 3 - 结论: ① 雷帕霉素能抑制大鼠颈总动脉拉伤引起的内膜增生; ② 雷帕霉素抑制大鼠颈总动脉拉伤新生内膜和血清中 SDF-1α 的表达; ③ 雷帕霉素浓度依赖性地抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的迁移和增殖; ④ 雷帕霉素浓度依赖性地抑制大鼠主动脉平滑肌细胞 SDF-1α 表达。 关键词: 雷帕霉素;内膜增生;基质细胞衍生因子-1α;血管平滑肌细胞; 迁移;增殖;表达 - 4 - Effect of Rapamycin on Stromal Cell-Derived Factor-1 Alpha Expression and Migration of Rat Vascular Smooth Muscle Cell ABSTRACT OBJECTIVE To investigate the anti-restenosis effect of rapamycin and it’s effect on stromal cell-derived factor 1 alpha(SDF-1α). METHODS The animal models of rat carotid artery intimal hyperplasia was established with balloon injury. 20 twelve weeks old rats was randomly divided into two groups: baseline group (n = 10) and rapamycin treatment group (n = 10, 25 mg/kg Rapamycin). HE staining was used to observe vascular lesions. Immunochistochemistry staining was used to detect the expression of SDF-1α in lesions. The migration of smooth muscle cells induced by SDF-1α was observed with transwell. The levlel of blood serum SDF-1α was measured by ELISA, Proliferation of vascular smooth cells was measured by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)method, Effect of different concentration of rapamycin(0、1、10、100ng/ml) on serum induced migration of vascular smooth cells was tested by transwell, Measurement of SDF-1αin mRNA and protein level was done by RT-PCR and western blot respectively. RESULTS Intimal hyperplasia was obviously induced by balloon injury. SDF-1αexpressed highly in lesions and rapamycin significantly reduced the expression of SDF-1α in intimal hyperplasia. SDF-1α can also induce the migration of smooth muscle cells with a concentration-dependent manner. The result of MTT showed that, rapamycin inhibted proliferation of VSMC with a concentration-dependent manner, all of the three concentration(1,10 and 100ng/ml) rapamycin reduced the number of VSMC signifantly(p<0.05 or p<0.01), all of the three concentration(1,10 and 100ng/ml) rapamycin inhibited the migration rate of VSMC signifantly(p<0.05 or p < 0.01), and concentration dependly, all of the three concentration(1,10 and - 5 - 100μmol/ml) rapamycin remarkably reduced SDF-1α expression both in mRNA and protein level(p<0.05 or p<0.01), When the concentration of rapamycin rised up to 100μmol/ml, SDF-1α expression both in mRNA and protein level was almost completely reduced. CONCLUSIONS ① Rapamycin inhibited intimal hyperplasia of balloon injury rat common carotid artery; ② Rapamycin inhibited SDF-1α level both in neointimal and blood serum; ③ Rapamycin inhibited proliferation and migration of rat VSMC concentration dependly; ④ Rapamycin inhibited expression of SDF-1α both in mRNA and protein level. KEYWORDS Rapamycin; Intimal hyperplasia; Stromal cell-derived factor-1alpha(SDF-1α); Vascular smooth muscle cells(VSMC); migration; proliferation Postgraduate:Jian-Jun Lei (Pathology and Pathophysiology) Directed by Professor Zuo Wang - 6 - 正 文 引 言 单纯球囊经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)及支架置入术已成为冠心病患者 的重要的治疗手段之一,但术后再狭窄(restenosis, Rs)率高达 20%~30%[1-2]。 雷帕霉素 (rapamycin, RPM)最初是作为一种免疫抑制应用于临床[3],雷帕霉素涂 层支架技术在治疗冠脉再狭窄的临床实验中已获得了满意的效果[4-6],但其分子 机制尚不十分清楚。研究发现,雷帕霉素能抑制血管平滑肌细胞增殖,抑制血管 平滑肌细胞表型的改变[7],抑制炎性因子的产生[8],促进平滑肌细胞凋亡[9],并 抑制血管平滑肌细胞迁移[10-11]。有关雷帕霉素能抑制血管平滑肌细胞增殖的研究 较多,研究也较深入,而对于抑制血管平滑肌细胞迁移的报道仅有数篇文献,且 有关其机制的研究很少。 基质细胞衍生因子 1 ( stromal cell-derived factor 1,SDF-1α) 是新近发现的趋 化因子,对血液干(祖) 细胞的归巢具有强烈的趋化能力,并能介导巨核细胞跨 内皮迁移,并且在与动脉粥样硬化发生、发展密切相关的单核细胞、受损后的内 皮细胞以及活化的血小板中均有表达,提示 SDF-1α 可能在动脉粥样硬化发生发 展过程中起着重要调节作用[12-13]。雷帕霉素抑制血管平滑肌细胞迁移是否与影响 SDF-1α 表达有关,目前尚不清楚。故本文拟通过球囊损伤建立血管内膜增生的 动物模型,再予以雷帕霉素干预,探讨雷帕霉素对 SDF-1α 在增生内膜中表达的 影响及其作用机制。并在大鼠主动脉血管平滑肌细胞体外原代培养细胞模型上研 究雷帕霉素对大鼠主动脉血管平滑肌细胞迁移的影响,及其对 SDF-1α 表达的影 响,进一步阐明其影响血管平滑肌细胞迁移的机制。 - 7 - 实 验 材 料 1. 材料和方法 1 实验动物:SD 大鼠由南华大学实验动物部提供。 2 主要试剂与配制 2.1 戊巴比妥钠购自中国医药集团上海化学试剂公司,去离子水配制成 1%的溶 液,抽滤除菌,室温保存; 2.2 伊红购自上海试剂三厂,95%酒精配制成 0.5%伊红酒精溶液; 2.3 中性树胶购自中国医药集团上海化学试剂公司; 2.4 多聚赖氨酸购自福州迈新生物技术开发公司; 2.5 DEPC 购自美国 Amersco 公司;. 2.6 TRIzol 购自 Invitrogen 公司; 2.7 逆转录试剂盒(ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)购于 Promega 公 司; 2.8 SDF-1α ELISA 试剂盒(R&D System: MCX120); 2.9 SDF-1α 一抗及二抗均购于武汉博士德公司; 2.10 β-ACTIN 抗小鼠一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗、辣根过氧化 物酶标记的羊抗兔二抗、即用型链霉素抗生素蛋白过氧化物(SABC)免疫组化 试剂盒和 DAB 显色试剂盒购自武汉博士德公司; 2.11 硝酸素纤维膜(NC)购自 Minipore 公司; 2.12 BCA 蛋白含量测定试剂购自 Hyclone-Pierce 公司; 2.13 Western blot 荧光检测试剂盒购自北京中杉金桥公司; 2.14 苏木素购自中国医药集团上海化学试剂公司,将苏木素 2g 溶于 100%酒 精 20ml 中,隔水加热;明矾 40g 溶于蒸馏水,加热溶解;将苏木素酒精溶 液缓慢加入明矾水溶液中,加热至沸,搅拌 2min,离火,加入一氧化汞 0.5g, 再移至火上加热,并用玻棒搅拌至深紫色,立即放入冷水中快速冷却,静置 一夜,过滤,密封保存,用前加入 5%冰醋酸 8ml; 2.15 DMEM 培养基购自 Gibco 公司; 2.16 胎牛血清购自北京元亨圣玛生物技术研究所; 2.17 封闭用羊血清购自武汉博士德生物工程有限公司; - 8 - 2.18 胎牛血清购自元亨圣马生物技术研究所; 2.19 SDF-1α 购自 R&D 公司; 2.20 其他试剂均为国产分析纯。 3 主要仪器与器材 3.1 全自动生化分析仪为日本日立公司产品,型号 CX717; 3.2 电脑自动组织脱水机为常州市中威电子仪器厂产品,型号 TSJ-Ⅲ型; 3.3 BMJ-Ⅲ型包埋机为常州郊区中威电子仪器厂产品; 3.4 BMJ-Ⅲ型病理组织包埋冷冻台为常州中威电子仪器厂产品; 3.5 切片机为美国 Thermo Shandon 公司产品,型号 325; 3.6 生物显微镜为日本 Olympus 公司产品,型号 BX51; 3.7 图像分析系统为武汉千屏影像技术有限责任公司产品,型号 HMIAS2000; 3.8 高速离心机为德国 Eppendorf 公司产品,型号 5084 及 5084R; 3.9 紫外分光光度计为美国 PE 公司产品,型号 Lambda25; 3.10 电子分析天平为美国 Sartorius 公司产品; 3.11 微量移液器(10μl、100μl、1000μl)为德国 Eppendorf 公司产品; 3.12 25.4×76.2mm 磨砂边载玻片为海门昌隆仪器有限公司产品,型号 7105; 3.13 18×18mm 盖玻片为海门昌隆仪器有限公司产品,型号 7201; 3.14 切片石蜡为上海标本模型厂产品; 3.15 垂直电泳仪及转膜系统为美国 BioRad 公司产品; 3.16 卧式电泳槽,北京六一仪器厂; 3.17 荧光显微镜(美国 Nikon 公司); 3.18 Transwell 迁移系统购于 Corning 公司。 - 9 - 实 验 方 法 1 血管内膜增生动物模型的建立和分组 健康雄性 12 周龄 SD 大鼠 20 只,体重 250~320 g。动物喂养 4 周后,用 2F 球囊导管自颈外动脉的近心端插入颈总动脉,建立颈动脉血管成形术模型。术后 随机分为普通饲料对照组和雷帕霉素组,每组 10 只,雷帕霉素的浓度为 25 mg/ kg 饮食,自由进食,喂养 4 周。 2 颈总动脉的病理学观察 2.1石蜡切片制备 将 10%中性缓冲福尔马林固定的标本经蒸馏水冲洗 0.5~1h→70%酒精浸泡 24h→80% 酒精浸泡 24h→95% 酒精 I 浸泡 30min→95% 酒精 II 浸泡 30min→100%酒精 I 浸泡 30min→100%酒精 II 浸泡 30min→100%酒精与二甲 苯混合液(1:1)浸泡 20min→二甲苯 I 浸泡 20min→二甲苯 II 浸泡 20min→软 蜡浸泡 10min→硬蜡浸泡 10min→包埋制成石蜡块→连续切片(厚度为 5μm)→ 摊片→60℃烤片 1h→石蜡切片室温保存备用。 2.2苏木素-伊红(HE)染色检测主动脉窦As病变 大鼠颈动脉动脉根部的连续切片中,隔6张取一张做HE 染色。程序如下:石 蜡切片60 ℃烤片30 min → 二甲苯Ⅰ浸泡3~5 min → 二甲苯Ⅱ浸泡3~5 min →95 %酒精浸泡3~5 min →85% 酒精浸泡3~5 min → 蒸馏水3~5 min → 苏木 素5 min →稍水洗后用1 %盐酸水溶液分化数秒钟 → 流水冲洗15min 以上 →0.5%伊红酒精溶液1min →85%酒精浸泡数秒钟 → 95%酒精浸泡数秒钟 → 100%酒精Ⅰ浸泡1~3 min → 100%酒精Ⅱ浸泡1~3 min → 二甲苯Ⅰ浸泡5 min →二甲苯Ⅱ浸泡 5 min → 中性树胶封片。病理组织实时摄像系统下采图,运用 多功能真彩色病理图像分析软件分析各组织切片的斑块面积,每个组织共取5个 切片,取均值。 3 免疫组化检测增生内膜中 SDF-1α 表达 3.1 载玻片防脱处理:将干净载玻片室温浸泡于多聚赖氨酸中 5min(室温低于 15℃ 时延长至 10min),捞片,置 60℃烤片 30~60min,以使多聚赖氨酸紧密 粘附于切片上; 3.2 石蜡切片常规脱蜡至水;石蜡切片 60 ℃烤片 30 min →二甲苯Ⅰ浸泡 3~5 min - 10 - →二甲苯Ⅱ浸泡 3~5 min →100 %酒精浸泡 2 min →95% 酒精浸泡 1 min→80% 酒精 1min→水洗充分; 3.3 30% H2O2 1 份+蒸馏水 10 份混合,室温 5~10min 以灭活内源性过氧化物 酶,蒸馏水洗 3min×3 次; 3.4 热修复抗原:将切片浸入 0.01M 枸橼酸盐缓冲液(pH6.0),电炉加热至沸腾 后断电,间隔 5min,反复 3 次;冷却后 PBS(pH7.2~7.6)洗涤 3min×3 次; 3.5 滴加 5%BSA 封闭液,室温 20min,甩去多余液体,不洗; 3.6 滴加 1:100 稀释的 羊抗鼠 SDF-1α 一抗,37℃1h 或 4°C 过夜;PBS(pH7.2~ 7.6)洗涤 3min ×3 次; 3.7 滴加生物素化鼠抗羊二抗 lgG,37℃20min,PBS(pH7.2~7.6)洗涤 3min×3 次; 3.8 滴加 SABC,37℃ 20min;PBS(pH7.2~7.6)洗涤 5min×4 次; 3.9 DAB 显色:使用 DAB 显色试剂盒。取 1ml 蒸馏水,加试剂盒中 A、B、 C 试剂各 1 滴,混匀后加至切片,室温显色,显微镜下控制反应时间,一般在 5~30min 之间,蒸馏水洗涤; 3.10 苏木素复染 5min,1% 盐酸水溶液分化数秒,流水冲洗 1h 以上; 3.11 梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜观察。 3.12 结果判定:以 PBS 代替一抗作为空白对照,标本无阳性反应细胞、背景 同 空白对照者为阴性。胞浆、胞膜显示棕黄色颗粒,核被衬染为淡蓝色者为 SDF-1α 阳性细胞。 3.13 图像分析:HMIAS2000 高清晰度彩色医学图文分析系统对染色强度进行定 量分析。灰度单位为从0~255 共256 个等级,其中0 代表黑色,255 代表白色。 随机选取3只/组小鼠胸主动脉行石蜡切片,每只小鼠选取3张非连续行免疫组化 染色切片,每张切片于40 倍物镜下随机抽测5个视野,每例标本共15个视野。测 定目标平均灰度、标定空白处平均灰度和目标面积,依据公式计算目标平均光密 度[24] ( mean optical density,MOD)。免疫反应越强,染色越深者,目标平均光密 度值越大。目标平均光密度= lg 标定空白处平均灰度/ 目标平均灰度。 4 大鼠血管平滑肌细胞的原代培养 采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞。取清洁 8 周龄雄性 SD 大鼠,颈椎脱臼法处死,无菌操作取出胸主动脉,置入含 DMEM 基础培养液的 - 11 - 培养皿中。在超净工作台上,眼科镊剥除血管外膜,纵行剪开血管,小心刮除内 膜,用 DMEM 漂洗血管段 3 次后,将血管剪成体积约 1mm3 的组织块,吸弃 上层漂浮的组织,将组织块均匀地贴附于 25ml 螺口培养瓶底面,每瓶 25~30 个 组织块。采用组织块翻转干涸法,将培养瓶翻转 180°,使培养瓶底面朝上,同 时在对侧加入含 20%小牛血清的 DMEM 培养基 3ml,移入饱和湿度、5%CO2、 37℃培养箱静置培养,3~4 小时后轻轻翻转培养瓶,让培养基缓慢淹没组织块, 继续静置培养,从第 3 天起,用倒置显微镜观察细胞生长情况,每周换液 2 次。 原代培养的细胞生长至汇合状态时,铺满瓶壁的 2/3 以上(约需 7~10 天), 即 可传代。传代时,吸去原有培养液,加 0.25%胰蛋白酶浸润细胞,置倒置显微镜 下观察,当细胞边开始回缩时,吸弃消化液,加入适量的培养液,用吸管吹打, 使细胞离壁形成悬液,按 1:2~3 分装接种,移入新培养瓶,每培养瓶约 2×105 个 细胞/3ml 。每 3~5 天传代一次,3~5 代细胞用于实验。 5 血管平滑肌细胞的鉴定 用 Alpha Smooth Muscle Actin 单克隆抗体的免疫细胞化学法鉴定。采用组 织贴块法在体外成功培养出 SD 大鼠胸主动脉平滑肌细胞。倒置相差显微镜下观 察细胞形态及生长状况。从第 4~5 天起,组织块周围可见有呈梭形、纺锤形的 细胞生长,以组织块为中心向外呈放射性生长,形成细胞晕。一般 7~10 天时, 相邻组织块的细胞晕相互融合,且铺满培养瓶底的 2/3 以上,出现―峰和谷‖样的 生长模式:多层细胞交叉重叠生长而形成―峰‖,―峰‖与―峰‖之间细胞呈单层或层 数少,细胞稀少散在,而称为―谷‖。―峰和谷‖样的生长模式,为血管平滑肌细胞 特异的生长特征。 操作步骤: 5.1 用胰蛋白酶消化的第 3 代细胞接种于 6 孔培养板中,培养板中预先置入高压 消毒的盖玻片,在 37℃二氧化碳培养箱中静置培养。 5.2 培养至盖玻片上细胞近 70~80%汇合时,小心取出盖玻片,置于载玻片上。 5.3 PBS 冲洗 3 次,每次 5min 。 5.4 4%多聚甲醛室温固定 30min,PBS 冲洗 3 次,每次 5min ,蒸馏水冲洗。 5.5 非特异性血清封闭,室温孵育 40min 。 5.6 倾去血清,滴加 α-Smooth Muscle Actin 单克隆抗体(1:100), 4℃孵育过夜。 - 12 - 5.7 PBS 冲洗 3 次,每次 5min 。 5.8 滴加二抗工作液,37℃孵育 30min 。 5.9 PBS 冲洗 3 次,每次 5min 。 5.10 SABC,37℃ 1h,PBS 洗 4 次,每次 5min。 5.11 DAB 显色:等体积 A、B、C 液混匀后,加至切片上,染色 2min 左右,并 在显微镜下观察显色程度,以调节显色时间的长短。 5.12 蒸馏水洗,苏木素复染 5s(可在显微镜下观察染色情况,以调节染色时间 的长短); 5.13 1%的盐酸酒精分色 2-4s 流水洗 1h。 5.14 70%乙醇中浸 5min,95%乙醇中浸 5min,无水乙醇中浸 5min,二甲苯中浸 15min。 5.15 中性树胶封片。 5.16 阳性结果判断:胞浆内呈棕褐色者为阳性。 5.17 取 5 个高倍镜视野,计数 100 个细胞中阳性细胞所占比例。经鉴定血管平 滑肌细胞纯度达 95%以上方可用于实验。 6 MTT法检测大鼠VSMCs增殖 四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma 公司,用去离子水溶解制成5 mg/mL 溶液, 0.22 μ微孔滤器过滤除菌,- 20 ℃保存。将第6~10 代对数生长期细胞用含 100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培养液调制成细胞悬液, 细胞密度5×104/mL, 接 种于96 孔板( Corning) 上,每组设6 个复孔,每孔200μL。另设6 孔空白对照, 每 孔只加培养液200 μL,无细胞。置于37℃、5%CO2 孵箱孵育24h,次日细胞贴壁 后, 换成含10 g/L牛血清白蛋白的DMEM培养液继续培养48 h, 使细胞同步于G1 早期。重新换回含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养液, 对实验细胞进行再刺激, 使其同时进入细胞周期循环, 同时各组分别加入不同浓度雷帕霉素进行干预。干 预48 h 后, 每孔各加入配好的MTT 溶液( 5 mg/mL) 20 μL, 作用4 h, 离心,吸弃 培养液。每孔加入DMSO 200 μL, 微量震荡仪轻微震荡20 min, 酶标仪双波长检 测490 nm处吸光度(A)值, 选择630 nm 作为参考波长, 重复3次。结果统计比照区 组设计的方差分析, SPSS中统计过程选用General linear model 中univariate 进 行。 7 Transwell 迁移实验 7.1 基质细胞衍生因子1α趋化大鼠血管平滑肌细胞迁移 - 13 - 单核细胞迁移采用8μm孔径的Transwell 迁移系统。平滑肌细胞均匀悬于含 0. 5 %胎牛血清的RPMI-1640 培养基中,然后加到上室(细胞密度为2×108 个/L)。 在下室加不同浓度的人重组SDF-1α(0、1、10、100μg/L)和含0. 5 %胎牛血清 的RPMI-1640 培养基,37 ℃孵育10 h 后取出上室,在300 ×显微镜下连续计数4 个视野的细胞数,取其平均值。 7.2 雷怕霉素对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响 (1) 实验细胞准备: 选择第 3~5 代生长良好的血管平滑肌细胞,待细胞贴壁生长至 70~80%汇 合时,吸弃原培养液,换用含 0.2%血清的 DMEM 培养液继续培养 24h。胰蛋白 酶制备细胞悬液,调整细胞密度为 2.5×105/ml 。 (2)细胞迁移 聚碳微孔膜用0.01%Gelatin 煮沸1小时,晾干后备用,实验前用铅笔编号。 采用改良的Boyden 微孔膜双槽法进行细胞迁移实验,下槽加入20%的血清及0、 1、10、100 ng/mL雷怕霉素处理,共计0.3ml,不足用DMEM 培养液补足。用8μm 孔径的聚碳微孔膜隔开上下槽,上槽加入0.4ml 密度2.5×105cells/ml 细胞悬液 (细胞总数为1×105)。置于37℃ 5%CO2 培养箱,温育4 小时后弃去上槽细胞悬 液,聚碳微孔膜移至染色架,用95%酒精固定10 分钟,0.5%甲苯胺兰染色40 分 钟后,用棉签轻轻刮去聚碳微孔膜朝上槽的一面留下多余的细胞,压片固定。留 在膜上的则为移行通过微孔附着在聚碳膜下槽面的VSMCs,用光学显微镜观察, 用预先画好5 个圆圈且与微孔膜等大的透明塑料膜扣于膜上,计算膜上相对固定 区域的5 个高倍视野(×200)的细胞数,每个点同时平行做3张膜,取均值。统 计学处理同前。 8 RT-PCR 将 ox-LDL 处理后的细胞,按 Trizol 试剂盒说明书提取总 RNA。取 2μg 各 组细胞总 RNA 逆转录合成 cDNA,再取 10μl 逆转录产物进行 PCR 循环。94℃ 温育 5 min,94℃变性 30sec,60 ℃复性 30sec,72 ℃延伸 30sec,共 30 个循环, 末次循环 72 ℃,延伸 10 min。SDF-1α 的引物序列:上游 5’-GGA CGC CAA GGT CGT CGC CGT G-5’,下游 5’-TCG GGT CAA TGC ACA C-3’。PCR 扩增产物长 度为 222bp。β-actin 的引物序列:上游 5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’, - 14 - 下游 5’-CGA TAG TGA TGA CCT GAC CGT-3’。PCR 扩增产物长度为 138 bp 。 反应结束后,取反应产物 5μL 进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色, UVP 型凝胶图像分析系统摄图,并分析各组目的基因及内参 β-actin、GAPGH 基因灰 度值,以二者的比值代表 SDF-1α 和 CXCR4 mRNA 的量。 9 Western blot 在收获好的细胞中加入三去污剂裂解缓冲液裂解细胞,于 4 ℃离心 10 min, 弃除沉淀。取 16μl 蛋白质溶液加入 5×SDS 凝胶加样缓冲液中,在 100 ℃加热 10 min 以使蛋白质变性。用 15% SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,转 PVDF 膜,丽春红染色观察转移效果, 并确定蛋白质分子量标准位置。封闭液封闭 2h, 按 1:200 加入羊抗人 SDF-1α 一抗,4 ℃培育过夜, TBST 洗三次, 1:2000 加 入辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗,室温培育 1h,TBST 洗三次,用 Western 印 迹荧光检测试剂盒显示于 X 光片。结果用 Labwork 凝胶图像分析系统对胶片扫 描,获取各条带的光密度值。 10 ELISA法检测SDF-1α血清水平 收集到的外周血肝素抗凝,1000g离心15min,取上清后低温高速离心机于4℃ 下10000g离心10min,去除血小板。预先向各反应孔(96孔板)加入50μl测定稀释液 RD1-55,然后将标准品和待测血清各50μl加入相应反应孔,封闭板孔,室温下于 振荡仪上500r/min孵育2h洗板,每孔依次加入100μlSDF-1α结合物,封板,室温 下于振荡仪上500r/min室温孵育2h洗板,每孔依次加入200μl底物溶液,室温下避 光孵育30min。加入50μl终止液,30min内在酶标仪上读取A540、A570值,并绘 制标准曲线,然后根据血清样本的A值,计算其浓度。 11 统计学分析 数据采用 x ±s 表示,组间比较采用方差分析和 t 检验, P 0. 05 为差异有统 计学意义。 - 15 - 实 验 结 果 1 雷帕霉素对大鼠颈总动脉拉伤内膜增生的影响 HE 染色的结果表明,球囊拉伤 4 周后,对照组大鼠颈总动脉有明显的内膜 增生形成,而雷帕霉素处理组则几乎无血管内膜增生性病变形成(图 1),大鼠 血清 SDF-1α 水平也显著下降(p 0.01,图 2)。 A B 图 1 HE 染色颈检测颈总动脉病变(×40), A 为对照组,B 为雷帕霉素组。 - 16 - 6 5 4 ng/ml α 3 1 * - 2 SDF 1 0 A B 图2 雷帕霉素对大鼠颈动脉拉伤的血清中SDF-1α水平的影响,*:与A比较,P 0.01 2 SDF-1α 对血管平滑肌细胞迁移的影响 小室迁移实验表明,SDF-1α 能明显诱导血管平滑肌细胞的迁移,并且呈浓 度依赖性,当下室中的 SDF-1α 浓度为 100μg/L,迁移的平滑肌细胞数为对照组 的 40 倍(图 3)。 * * * 图 3 SDF-1α 对血管平滑肌细胞迁移的影响。横坐标为 SDF-1α 的浓度(0、1、10、100μg/L), 纵坐标为迁移的平滑肌细胞数目(个)。*:与 0μg/L 比较,P 0.01 3 雷帕霉素对内膜SDF-1α表达的影响 免疫组化的结果表明,在增生内膜中有明显的 SDF-1α 的表达,并且主要分 布在增生内膜以及血管中膜的平滑肌细胞,而雷帕霉素处理组则仅仅在受损血管 内表面有少量的 SDF-1α 的表达(图 4)。 - 17 - A B 图 4 免疫组化检测 SDF-1α 在颈总动脉病变中的表达(×200), A 为对照组,B 为雷帕霉素 处理组。 4 血管平滑肌细胞的鉴定 爬片法使血管平滑肌细胞在盖玻片上生长(图5C), 培养至第5代的细胞经 特异的平滑肌α-actin免疫细胞化学染色后,胞浆着色,呈阳性反应,高倍镜下可 见胞浆中沿细胞纵轴密集排列的束状肌丝被染成棕黄色为平滑肌α肌动蛋白丝, 细胞纯度在98%以上(图5B)。 - 18 - C 图5免疫组织化学鉴定平滑肌细胞(A和B,40×;C,10×) A:倒置显微镜下的平滑肌样细胞,B:免疫组织化学鉴定平滑肌细胞,可见细胞中有大量 棕色颗粒,C:大鼠血管平滑肌细胞爬片结果。 5 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 雷帕霉素抑制体外培养的鼠平滑肌细胞增殖MTT 法检测显示雷帕霉素呈剂 量依赖性抑制体外培养的大鼠平滑肌细胞增殖(表1)。统计分析结果,1 ng/mL(p 0.05)、10ng/mL(p0.05)和100ng/mL(p0.01)的雷怕霉素均显著抑制大鼠血管平滑 肌细胞的增殖。各组平滑肌细胞增殖情况见图6。 - 19 - 表 1 雷怕霉素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 ( x ±s,OD,n=6) Block Control 1 ng/mL 10 ng/mL 100 ng/mL 1 0.853±0.051 0.775±0.046 0.675±0.058 0.413±0.056 2 0.926±0.046 0.769±0.055 0.767±0.037 0.574±0.113 3 0.915±0.078 0.781±0.032 0.689±0.061 0.506±0.047 total 0.898±0.058 0.775±0.044* 0.710±0.052* 0.497±0.072# *:P<0.05,#:P<0.01,与control相比较 A B - 20 - C D 图 6 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响(10×)。A:对照,20%的小牛血清;B: 1ng/ml 雷帕霉素处理组;C:10ng/ml 雷帕霉素处理组;D:100ng/ml 雷帕霉素处理组 6 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响 通过在下槽加入20%的血清诱导大鼠血管平滑肌细胞迁移,结果显示:1(P <0.05)、 10(P<0.01)、 100(P<0.01)ng/mL雷怕霉素处理均能显著抑制其向下 室迁移,其中以100 ng/mL雷怕霉素处理尤为明显,对照组细胞迁移数目是100 ng/mL雷怕霉素的近30倍(图7)。 - 21 - A B - 22 - C D - 23 - 350 300 * 250 200 150 100 # 50 # Cells number 0 C 1 10 100 图7 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响。A:对照,20%的小牛血清;B:1ng/ml 雷帕霉素处理组;实物图C:10ng/ml雷帕霉素处理组;D:100ng/ml雷帕霉素处理组;统计 图C:对照组,1:1ng/ml雷帕霉素处理组(n=3;10:10ng/ml雷帕霉素处理组(n=3);100: 100ng/ml雷帕霉素处理组(n=3),*:P<0.05,#:P<0.01,与统计图上的C(对照组)相 比较 7 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞SDF-1α表达的影响 通过 RT-PCR 检 SDF-1α mRNA 水平,结果显示:1(P<0.05)、 10(P<0.01)、 100(P<0.01)ng/mL 雷帕霉素处理均能显著抑制 SDF-1α mRNA 生成,其中以 100 ng/mL 雷帕霉素处理尤为明显,对照组 SDF-1α mRNA 数值是 100 ng/mL 近 7 倍(图 8)。 β-actin SDF-1α 500bp - 24 - 5 4 * 3 # 2 1 # 0 1 2 3 4 图 8 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞 SDF-1α mRNA 表达的影响。细胞经 0、1、10、100ng/ml 的雷帕霉素处理 48h 后 SDF-1α 表达的改变(#:P<0.01, *:P<0.05,与对照组相比较); 1:0ng/ml,2:1ng/ml,3:10ng/ml,4:100ng/ml,M:Marker 通过 western blot 检测大鼠血管平滑肌细胞 SDF-1α 表达,结果表明:1(P <0.01)、10(P<0.01)、100 (P<0.01)ng/mL 雷帕霉素处理均能显著抑制 SDF-1α 蛋白表达,其中以 100 ng/mL 雷帕霉素处理尤为明显,对照组 SDF-1α 蛋白表达 数值是 100 ng/mL 雷帕霉素处理组的近 30 倍(图 9)。 1 2 3 4 SDF-1α β-actin - 25 - 5 4 3 2 # 1 # # 0 1 2 3 4 图 9 雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞 SDF-1α 蛋白表达的影响。细胞经 0、1、10、100ng/ml 的雷帕霉素处理 48h 后 SDF-1α 表达的改变,1:0ng/ml,2:1ng/ml,3:10ng/ml,4:100ng/ml, M:Marker;#:P<0.01,与对照组相比较 - 26 - 讨 论 近年来,经皮腔内血管成形术(PTA)、冠脉气囊成形术(CBA)等血管手术的 应用逐步推广。但是,由内膜增生(IH)导致术后血管再栓塞的存在,一直是困 扰血管外科的难题,它使手术后远期通畅率难以提高,导致复发,有报道即便即 时通畅率>95%的 PTA 病例中,6 个月再栓塞率达 30%-50%。 近年来的研究发现,雷帕霉素具有抑制血管内膜增殖的作用。雷帕霉素涂层 支架技术治疗冠脉再狭窄的临床RAVEL实验表明,雷帕霉素涂层支架可以有效 的预防急性、亚急性及后期靶血管的闭塞,改善患者的长期预后[15-16]。并且 Hausletiter[17-18]等的研究表明,口服雷帕霉素可减少支架内狭窄患者再狭窄的发 生。机制研究发现,RPM特异地作用于细胞周期调节酶(mTOR) FK506 结合蛋白 (FKBP12)。血管内膜受损时,位于VSMC 上的FKBP12 活性显著上调,为RPM 提供作用靶点[19] 。RPM 与FKBP12 结合的复合物却可强烈抑制mTOR,阻断细 胞因子(如IL-2 、IL-15 和CD28/B7 等刺激途径)对mTOR激活,导致VSMC 内 kipl pRB 的磷酸化被抑制,E2F 的释放和转录受阻;p27 介导CDK2 循环素E 的 激活和DNA 的合成被抑制;另外,还可导致P70S6 激酶活化被抑制,限制核糖 体蛋白S6 磷酸化,使核糖体/转录蛋白的合成减少[20-21]。 雷帕霉素具有抑制血管血管平滑肌细胞迁移:血管中膜的血管平滑肌细胞和 /或血液源性平滑肌祖细胞向血管内膜的迁移是内膜增生中的主要环节,而对于 抑制血管平滑肌细胞迁移的报道仅有数篇文献,有关其机制的研究更少。已有的 研究发现,雷帕霉素与钙调磷蛋白磷酸酶抑制剂吗乙麦考酚酸莫酯联合运用,可 显著抑制血管受损后的内膜增生,2 者均能抑制平滑肌迁移相关基因的表达,即 抑制基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9 和 TGF-β 的表达[10]。1-磷酸-鞘氨醇 所诱导的大鼠血管平滑肌细胞迁移可完全被雷帕霉素(10 nmol/L)所抑制,1- 磷酸-鞘氨醇可使 ERK1/2、38(MAPK)和 p70S6K 上调,雷帕霉素通过与其哺乳 动物雷帕霉素靶 p70S6K 作用,阻止 p70S6K 的酶活性中相关的 389 位苏氨酸磷 酸化,减少 ERK1/2 的磷酸化,故雷帕霉素的抑制作用与 ERK1/2 途径有关[11]。 SDF-1α 属于 CXC 超家族成员,最初认为系 B 淋巴细胞生长因子,以及 T 淋 巴细胞和单核细胞的趋化因子。随着研究的不断深入,发现 SDF-1α 及其受体 CXCR4 在造血干细胞归巢骨髓的过程以及动脉粥样硬化病变的过程中发挥重 - 27 - 要作用。Abi Younes[22] 等研究发现,冠状动脉粥样斑块内的平滑肌细胞、内皮细 胞和巨噬细胞中趋化因子 SDF-1α 水平明显升高,而高表达的 SDF-1α 可通过其 受体 CXCR4 来诱导血小板聚集和活化。Schober[23] 等发现在 apoE- / - 大鼠颈动 脉导丝损伤后新生内膜形成过程中 SDF-1α 着色主要局限在平滑肌细胞,并且用 SDF-1α 单克隆抗体治疗颈总动脉损伤后的载脂蛋白 E 大鼠 3 周,可使新生内膜 减少 44 %,表现为新生内膜中的平滑肌细胞成分减少,认为 SDF-1α 通过调节新 生内膜的平滑肌成分在 apoE- / - 大鼠损伤颈动脉后新生内膜形成方面发挥着重要 作用。 虽然发现 SDF-1α 在 As 斑块内高表达,但其在 As 和血管再狭窄过程中到底 扮演什么角色,到目前为止还不清楚,然而 SDF-1α/CXCR4 在 As 血管再狭窄过 程中的重要性不容忽视,以下研究显示 SDF-1α/CXCR4 存在从多种角度参与 As 和血管再狭窄形成的可能性。①介导单核细胞/内皮细胞、单核细胞/平滑肌细胞 之间的黏附。SDF-1α 在体外能引起单核细胞与内皮细胞层的黏附[24];LDL 引起 单核细胞与内皮细胞的黏附与 SDF-1α/CXCR4 密切相关,培养的内皮细胞有少 量基础水平的 SDF-1α、CXCR4 表达,LDL 对 2 者都有上调作用,SDF-1α 抗体 则抑制这种黏附[25-26],不用 LDL 刺激,直接把 SDF-1α 基因转染到内皮细胞上, 也 能 加 强 这 种 黏 附 [27] ; 单 核 细 胞 与 平 滑 肌 细 胞 的 黏 附 也 依 赖 于 SDF-1α/CXCR4[28]。最近又在活化的内皮细胞上发现了 SDF-1α又一受体 CXCR7, SDF-1α/CXCR7 在介导内皮细胞与单核细胞之间的黏附中也发挥重要作用[29]。② 血小板表达功能性的 CXCR4,SDF-1α 可活化并引起血小板聚集[30-31],并趋化其 进入病灶而促进血管壁的炎症反应[32]。③参与内膜增生:SDF-1α 动员和募集血 液中的平滑肌祖细胞,参与新生内膜形成,用 SDF-1α 单抗中和动脉内膜损伤所 产生的 SDF-1α,内膜增生明显受到抑制 [33-34],更直接的证据是转入突变的 SDF-1α 基因后内膜增生的面积减少近 50%[33],M-CSF 在动脉内皮损伤的早期可 通过 SDF-1α/CXCR4 介导内膜增厚[35]; SDF-1α 能引起血管平滑肌细胞活化, 分泌细胞外基质,引起内膜增生[30-31] [36]。④俘获、趋化炎性细胞进入血管壁。 新生内膜的平滑肌细胞表达的 SDF-1α 能趋化 T 细胞[36]、单核细胞[37]进入血管壁, SDF-1α 还能刺激 T 细胞产生细胞因子 IL-2、INF-γ[38]。⑤SDF-1α/CXCR4 是体内 重要的免疫调节轴 [39-41], SDF-1α/CXCR4 在免疫因素致 As 和血管再狭窄作用 - 28 - 中扮演何种角色,总之,SDF-1α/CXCR4 存在多重致 As 和血管再狭窄作用潜质, 系统地研究 SDF-1α/CXCR4 在 As 和血管再狭窄形成中的作用十分必要,势在必 行。 我们的实验发现在雷帕霉素能显著抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生,免疫 组织化学染色显示在球囊损伤诱导的增生内膜中有大量的 SDF-1α 的表达,并且 主要表达于增生内膜以及血管中膜中的平滑肌细胞,而雷帕霉素处理后,仅仅少 量的 SDF-1α 主要表达于受损血管表面,提示雷帕霉素明显抑制 SDF-1α 的表达。 小室迁移实验发现,SDF-1α 明显诱导血管平滑肌细胞迁移,并呈浓度依赖性。 因此我们推测雷帕霉素通过抑制 SDF-1α 的表达从而抑制中膜的平滑肌细胞的迁 移,从而抑制球囊损伤血管内膜的发生和发展。进一步的细胞实验结果证明该推 测是正确的,1、10、100ng/ml 的三个浓度的雷帕霉素均能显著抑制 VSMC SDF-1α mRNA 和蛋白的表达,且其抑制 SDF-1α 蛋白尤为明显,研究结果为雷帕霉素的 抗再狭窄作用提出了新的作用机制,同时也为 SDF-1α/CXCR4 参与 As 和血管再 狭窄形成提供了新的证据。但极低浓度(6nmol/L)的雷帕霉素能促进 VSMC 释 放 SDF-1α,促进基质干细胞向受损血管处着床并向收缩型的血管平滑肌分化[42], 因此有必要深入研究雷帕霉素对 SDF-1α 表达的调节作用。 - 29 - 结 论 ① 雷帕霉素能抑制大鼠颈总动脉拉伤引起的内膜增生; ② 雷帕霉素抑制大鼠颈总动脉拉伤新生内膜和血清中SDF-1α 的表达; ③ 雷帕霉素浓度依赖性地抑制大鼠主动脉平滑肌细胞的迁 移和增殖; ④ 雷帕霉素浓度依赖性地抑制大鼠主动脉平滑肌细胞SDF-1 α表达。 - 30 - 参考文献 [1] 王祥,冯义柏,曹林生,李裕舒,尹爱珍,毛奕,吴桂芳. 冠状动脉内支架 置入术在冠心病治疗中的应用. 临床心血管病杂志. 2002, 18(5) :202火凤凰玄机论坛